مقاله مقدمه ای بر بیوتکنولوژی انتقال ژن در ماهی با word دارای 50 صفحه می باشد و دارای تنظیمات در microsoft word می باشد و آماده پرینت یا چاپ است
فایل ورد مقاله مقدمه ای بر بیوتکنولوژی انتقال ژن در ماهی با word کاملا فرمت بندی و تنظیم شده در استاندارد دانشگاه و مراکز دولتی می باشد.
این پروژه توسط مرکز مرکز پروژه های دانشجویی آماده و تنظیم شده است
توجه : در صورت مشاهده بهم ریختگی احتمالی در متون زیر ،دلیل ان کپی کردن این مطالب از داخل فایل ورد می باشد و در فایل اصلی مقاله مقدمه ای بر بیوتکنولوژی انتقال ژن در ماهی با word،به هیچ وجه بهم ریختگی وجود ندارد
بخشی از متن مقاله مقدمه ای بر بیوتکنولوژی انتقال ژن در ماهی با word :
مقدمه:
یکی از زمینه های که امروزه بیوتکنولوژیست ها روی آن تحقیق می کنند ایجاد گونه های ترانسژنیک است. طبق تعریف ترانسژنیک موجودی است که، دارای DNA نو ترکیبی باشد. به طوری که در ژنوم آن موجود ژن نو ترکیب بیان می شود. بیان ژن خارجی یکی از جنبه های تولید ترانسژنیک و انتقال DNA به زاده های هدف بعدی می باشد. در این زمینه تکنیک میکرواینجکش در انتقال ژن به تخم مهره داران اولین بار به وسیله گوردون (Gordon) و همکاران در سال 1980 گزارش شد. در این تکنیک یک لوله مؤئین شیشه ای را برای وارد کردن DNA نو ترکیب به پیش هسته نریا با سیتوپلاسم تخم لقاح یافته موش به کار گرفتند. در همین سال میکروانجکش مستقیم DNA نو ترکیب در شرایط آزمایشگاهی جهت ایجاد حیوانات ترانسژنیک مورد استفاده قرار گرفته است. طوری که ژن را از این طریق وارد تخم های لقاح نیافته یا لقاح یافته
موجوداتی نظیر جنین توتیای دریایی، موش، قورباغه، مگس سرکه، خرگوش و خوک کرده اند (Brem 1988) در سال 1985 زئو (Zhu) و همکاران ژنی شامل پرتومتالوتیونین موش و ژن هورمون رشد انسانی را به ناحیه مرکزی صفحه زایای تخم های لقاح یافته ماهی طلایی تزریق کردند و قسمتی از این ژن را در DNA ماهیان مشاهده کرند. در همین سال روکونس (Rokkones) تکنیک میکرواینجکشن دو مرحله ای بر روی تخم آزاد ماهیان را شرح داده است. در این تکنیک ابتدا به کمک یک وسیله نوک تیز فلزی در قطب حیوانی سوراخی ایجاد شده و از طریق این سوراخ محلول حاوی DNA نو ترکیب به کمک پی پت ریز تخم شدند به طوری که به کیسه زرده وارد نشوند. پس از 14 روز پلاسمیدهای کامل را مشخص کردند. چوروت (Chourrout) و همکاران در سال 1986 روش فوق را بر روی قزل آلای قهوه ای رنگ به کار برند با توجه به وجود DNA خارجی همراه با ملکولهای DNA میزبان پیشنهاد شده که این ژن به داخل ژنوم ماهی وارد شده است. محققان به ورش دستی یا از طریق هضم آنزیمی از جمله با تریپسن
کوریون را برداشته و تزریق میکرواینجکشن انجام دادند. در همین سال اوزاتا (Ozata) ماهی کوچک مدوکا را به عنوان مدلی برای ترانسژنیک مطرح کرد. او پلاسمیدهای حاوی ژن کریستالین جوجه را به هسته تخم ها از طریق میکرواینجکشن وارد کرد. به علت کوریون سفت در تخم لقاح یافته تعدادی از ماهیان استفاده از میکرواینجکشن مشکل و مستلزم اتلاف وقت زیادی است. به همین منظور روشهایی جهت غلبه بر این مشکل به کار گرفته شده است. از جمله در سال 1988 بریم (Brem) و همکاران ژن هورمون رشد انسان را به کمک وکتور مناسب از طریق میکروپیل به صفحه زایای تخم های تیلاپیا تزریق کردند و رشد بچه ماهیان طی 90 روز بررسی شد. مشابه این
تحقیق توسط فلت چر (Fletcher) و همکاران در همین سال بر روی ماهی آزاد اتلانتیک انجام شد. همچنین تکنیکهای دیگر شامل الکتروپورشن (Electroporation) شلیک ذرات ژن Shatagun بر روی تخمک و طراحی لیپوزوم جهت ورود به زرده تخم انجام شده است. میکر واینجکشن نیاز به مهارت زیادی دارد و از طرفی سرعت آن کم و هزینه و تجهیزات آن زیاد است و مستلزم زحمات و زمان زیادی برای ایجاد تعداد زیادی از ما هیان ترانسژنیک است علاوه بر این از دیگر مشکلات آن این است که در تخم های القاح یافته اغلب ماهیان هسته به وسیله میکرسکوپ قابل روئیت نیست بنابراین DNA را به سیتو پلاسم تزریق می کنند.
در مجموعه تحقیقات انجام شده، میزان باقی ماندگی جنین هایی که مورد تزریق قرار گرفته اند بین 50 تا 80 درصد گزارش شده است. و کارآیی میزان بیان ژن بین 3 تا 70 درصد بوده است. باقی ماندگی جنین ها و کارایی بیان ژن وابسته به فاکتورهایی نظیر سیستم بافری، غلظت DNA و روش های مورد استفاده در تزریق می باشد. لذا در مراحل بعدی غلبه بر این مشکلات مورد توجه قرار گرفت به طوری که ضمن ساده کردن تکنک و کم کردن هزینه ها کارآیی را افزایش می دهند تا در عمل بتوان در تکنولوژی تکثیر و پرورش آبزیان تعداد زیادی از ماهیان ترانسژنیک را ایجاد کرد. بنابراین روش استفاده از اسپرم جهت انتقال ژن مطرح شد. اگر چه مفهوم بکارگیری اسپرم به عنوان یک ناقل مسئله جدیدی نیست بلکه در سال 1971 براکت (Brackett) با وارد کردن ژن خارجی به اسپرم خرگوش و در سال 1987 فریمن (Fareeman) بر روی ماکیان این تحقیق را انجام داده اند و در سال 1989 لویترانو (Lavitrano) این تکنیک را بر روی موش به کار گرفته است. در سال 1992 کهو (Khoo) تکنیک استفاده از اسپرم به عنوان ناقل را جهت وارد کردن ژنهای جدید به ماهی زبر به کار گرفت. همچنین در سال 1993 ایکسی (Xie) و همکاران جزئیات انتقال ژن از طریق اسپرم به کمک التروپورشن (Electroporation) بر روی ماهیان لوچ (Loach) و کاراس (Crucian) را شرح داده اند. در همان سال (سین) Sin و همکاران انتقال ژن به ماهی چنوک (Chinook) را با همین تکنیک شرح دادند. در این نوشتار جزئیات دستکاریهای ژنی در ماهیان با ذکر مثالهایی بررسی شده است.
1-1- به کار گیری پروموتر از ژن ماهیان
گزارشهای اندکی در ارتباط با تحقیقات به کارگیری پروموتر از ماهی در دسترس است. در ماهی قزل آلای رنگین کمان دو فرم مشابه از ژنهای متالوتیونین بنام B,A وجود دارد. اگر چه پروموترژن B قادر به بیان ژن گزارشگر در محیطهای کشت سلولی است. ولی درباره این ویژگی پروموترژن B در سلولهای ماهی اطلاعات کمی وجود دارد. به منظور طراحی و کتورهای مناسب برای ما هی و مطالعه تنظیم بیان ژن در داخل بدن و شرایط آزمایشگاهی پروموترن ژن B متالوتیونین ماهی قزل آلا جدا شد. پس از PCR نقش آن در بیان ژن در لاینهای سلولی انسان و ماهی توسط هونگ (Hong) به کار گرفته شد. به همین منظور وکتور بنام PtMTb – CAT که دارای 6/4 کیلوباز است
طراحی گردید. حدود 261 حفت باز وکتور مربوط به پروموترژن B متالتیونین قزل آلای رنگین کمان (tMTb) کیلو باز آن ژن کلرامفنیکل استیل ترانسفراز (CAT) و سیگنال پلی ادنیلاسیون ویروس SV40 و همچنین 7/2 کیلو باز آن قطعه ای مربوط به پلاسمید PUC18 بوده است همچنین طراحی آن بر پایه ساختمان pBL – CAT تکمیل شده بود. به طوری که طراحی BL پرایمری دارای سکانس اولیگونکلئوتیدی بر اساس ردیف نکلئوتیدهای سمت 5 از 250 تا 221 ژن MTb ماهی قزل آلا بوده و دارای محل ویژه ای جهت
برش توسط آنزیم EcoRI بوده است. همچنین در ساختمان پلاسمید ptMTb – CAT قطعه 261 جفت بازی پروموتر tMTb در جلوی ژن CAT در ساختمان CAT pBL- قرار گرفته است. در کنار این چهار وکتور دیگر طراحی گردید، که شامل pBL-CAT2-1 که در آن پروموتر تیمیدین کیناز (TK) ویروسی در بالا دست ژن CAT قرار داده شده بود. pBL-CAT3-2 بر اساس pBL-CAT2 که در آن پروموتر TK برداشته بود طراحی شد pTK-CAT2E-3 که در پلاسیمید PBL-CAT2 تعداد 72 جفت باز تکراری از اینهنسر SV40(Enhancer) به صورت دوبل به ابتدای ژن CAT اضافه شده بود. PhMT IIA-4 که تعداد 850 جفت باز دارای محل ویژه برش Hind III/NcoI از پروموتر آن متالوتیونین IIA انسانی (HmtIIA) به ژن CAT در ساختمان
pBL-CAT3 اضافه شده بود این وکتورها به روی 4 لاین سلولی ماهی و یک لاین انسانی به کار گرفته شدند. طوری که در آن سلولها با میزان 5/3 پیکومولار از DNA پلاسمید آلوده شدند جزئیات نتایج در جدول شماره یک آمده است.
جدول 1- سنجش فعالیت پروموتر در یک لاین سلولی انسان و چهار لاین سلولی ماهی
Cell lines Constructs
PSM A2 EPC RTH HepG2
0.43
n.b.c
100.00
0.55
0.43
(0)
0.40
(0)
0.96
13.26
(13.84)
5.66
(5.91) 0.52
n.b.c
100.00
0.74
4.53
(6.16)
11.62
(15.80)
3.71
99.28
(26.64)
98.12
(26.33) 0.27
3.67
100.00
0.5
10.95
(21.9)
1.02
(2.04)
3.68
139.00
(37.77)
106.67
(29.00) 1.16
3.14
100.00
1.40
39.11
(27.94)
7.18
(5.13)
14.11
480.69
(34.07)+227.48
(16.12) 0.13b
1.00
100.00
0.10
0.33
(3.30)
0.11
(1.10)
1.21
72.56
(69.20)
13.90
(11.50) pBL – CAT3
pBL – CAT2
pTK-CAT2E
ptMTb CAT
+zinc
+cadmium
phMTIIACAT
+zine
+cadmium
EPC (Carp epithelioma Papulosum) , PTH (Rainbaw trout hepatoma)
Hep (Human hepatoblastoma) , PSM (Xiphophorus interspecific melanoma) , A2 (xiphophorus xiphidium emryonal epitheloid )
جهت بررسی اثرالقاء فلزات بر روی ژن، لاین های سلولی ماهی آلوده با پلاسمید ptMTb- phMTIIA – CAT , CAT برای مدت 48 ساعت قبل از برداشت، تحت اثر ZnCI2 یا CdCI2 قرار داده شدند. سنجش CAT بر طبق روش فریدین ریچ (Friedenreich) در سال 1990 انجام شده که در آن فعالیت پروموتر به وسیله درصد تبدیل CAT با مقایسه استیل کلرامفنیل (3-Ac) و کلرامفتیکل (Cm) به شرح زیر تعیین شد.
پروموتر tMTb در تمام لاین های سلولی به جز لاین سلولی PSM فعال بوده است. بنابراین القاء ناشی از فلزات بر روی پروموتر tMTb بستگی به منشاء سلولها و نوع آنها دارد علاوه بر این در بین چهارلاین سلولی بیشترین القاء در فعالیت پروموتر در لاین سلولی RTH بوده است و لاینهای A2 , EPC در مراتب بعد قرار داشتند. این نتایج در کنار این حقیقت که در مهره داران سنتز عمده متالوتیونین در کبد اتفاق میافتد نشانگر این است که، این تکنیک میتواند روشی برای ابزار ژن متاتیونین در سایر انواع سلولها باشد. همچنین پلاسمید tMTb= CAT p را به سیتوپلاسم یکی از دو سلول مرحله جنینی ماهی مدوکا از طریق میکرواینجکش تزریق کردند و مشاهده شد که ژن CAT در
تعداد محدودی از جنین ها براز شده است. تحقیقات هونگ و همکاران نشان داد که، پروموتر ماهی در سلولهای ماهی کارایی بیشتری از سایر سلولها نظیر انسان داشته استم. محدودیتهای زیادی در استفاده از پروموترهای چند گانه غیر متجانس (Heterologous) برای مطالعات ابزار ژن در شرایط زیستی و آزمایشگاهی در زمینه تولید ماهیان ترانسژنیک وجود دارد. با توجه به اینکه پروموتر tMTb نقش غیر محسوسی در بیان ذاتی ژن داشته است طوری که تحت اثر فلزات سنگین القاء شده و سبب ابزار ژن گزارشگر می شود. این پروموتر، برای ایجاد ماهیان ترانسژنیک با ژن ساختمانی شناخته شده و فهم عمل ژنهای جدید مناسب است.
2-1- بیان ژن هورمون رشد ماهی در باکتریچ
هورمون رشد یک پلی پپتید تک زنجیره است که به وسیله هیپوفیز پیشین تولید و ترشح می شود. در مهره داران اولین نقش هورمون رشد افزایش رشد سوماتیکی است علاوه بر این ماهیان استخوانی این هورمون در تنظیم شرایط اسمزی و تعادل الکترولیتی بدن و چندین عمل متابولیکی دیگر نقش دارد. ساختار ژن هورمون رشد و بیان آن، از مدلهای مهم برای مطالعه رابطه سا ختمان و عمل پروتئین و تنظیم بیان ژن است، طی تحقیقی که سال 1993 توسط سونگ (Song) و همکارانش انجام شد جداسازی
ژن هورمون رشد و تولید پلی پپتید آن به میزان بسیار زیاد در میکروارگانیسم ها بررسی شد. در سالهای اخیر در بسیاری از ماهیان این ژن از طریق cDNA کلون شده است. از جمله در یکی از فعالیتهای تحقیقاتی ژن هورمون رشد ماهی آزاد چنوک (Chinook salmon) از این طریق جدا و به باکتری اشیرشیاکلی تزریق شده است (Song 1993) در این تکنیک ابتدا cDNA هورمون رشد و جدا و کلون شد. cDNA 2/1 کیلو جفت باز بوده و در ساختار pSGH4 طراحی شد. سپس دو تا پروب الیگونکلئوتیدی و پرایمر برای آن ساخته شد.
طراحی پروبها و پرایمرها بر اساس ردیف اسیدهای امینه به روش باندهای فسفر دی استری روی فاز جامد انجام گرفت. پروب A بر اساس ردیف رزیدوهای 7-1 و پرب B بر اساس رزیدوهای 172-166 طراحی شدند و به وسیله الکتروفورز روی ژل اکریل آمید خالص گردیدند. همچنین طراحی پرایمرهای 1و2 بر اساس الگوی cDNA انجام شد. سپس آمپلی فیکاسیون ژن هورمون رشد به وسیله PCR انجام و محصولات PCR به وسیله الکتروفورز روی ژل آگاروز چک و با اتانل رسوب داده شدند و در قدم بعدی پلاسمید لازم برای بیان ژن طراحی گردید. و ژن مدیفای شده cDNA هورمون رشد به وسیه آنزیمهای برش دهنده Bam HI , Eco RI برش به ناقل پلاسمیدی که آن هم به وسیله همین آنزیمها برش شده بود منتقل شد.
سپس پلاسمید طراحی شده به باکتری Ecoli JM105 وارد گریدند نو ترکیب به وسیله پروب نشانه گذاری شده A مشخص شدند. کلونهای که ژن به آنها وارد شده بود. به نام pmAK5 نامیده شدند. اگر چه جهت تأئید بیشتر مجدد این کلونها تحت اثر آنزیمهای برش دهنده قرار داده شدند و با پروب نشانه B هیربد شدند. سپس اشیرشیا کولی های Ecoli K12 – JM105 حاوی پلاسمید pmAK5 که دارای ژن هورمون رشد بودند در محیط کشت YT کلون شدند. پس از انکوباسیون باکتریها با ایزوپروپیل دی تیوگالاکتو پیرانوزید (IPTG) برای مدت 4 ساعت در دمای 37 درجه، سلولها جدا و در بافر لایملی (Laemmli 1971) حل و با SDS-PAGE و کماسی بررسی شدند. نتایج نشان داد که به طور تخمین میزان 10-6 درصد از مجموع تمام پروتئین سلولی در اشیرشیاکولی مربوط به ژن هومون رشد بوده است.
3-1- انتقال ژن به تخم ماهی از طریق میکروپیل با میکروپیپت
در سال 1998 بریم و همکاران در تحیقیقی ژن هورمون رشد انسان را از طریق میکروپیل به صفحه زایای ماهیان تیلاپیا انتقال دادند رشد ماهیان طی 90 روز بررسی شد. جهت تکثیر، تعداد 4 یا 5 ماهی ماده را در کنار یک ماهی نر قرار دادند به طوریکه در شرایط آزمایشگاهی تخمک گذاری ماهیان ماده انجام و با اسپرم لقاح شدند. تخم های لقاح یافته 10 دقیه پس از تخمک گذاری در شرایط مصنوعی برداشته شدند. تمام تخم ها به انکو باتورهای ویژه با جریان آب و دمای منتقل شدند و تا زمان دست کاری نگهداری گردیدند. تزریق به تخم ها در زمانهای 10 دقیقه و 24-21 و 43-40 ساعت پس از تخمک گذاری انجام شد. ساختار پلاسمیدی که در انتقال ژن به تیلاپیا به کار
گرفته شد بنام 1- pXGH در تصویر 4 نشان شده است. این پلاسمید دارای 31/9 کیلوباز شامل 35/2 کیلو باز از قطعه ای از BPV-1 که دارای دو محل ویژه برش توسط آنزیمهای EcoRI , Bam H1 می باشد. تصویر 4- ساختمان پلاسمید pXGH-1 و جایگاههای مورد شناسایی آنزیمهای برش دهنده از طرف دیگر 46/2 کیلو باز آن از قطعه ای از پلاسمید pBR322 و 4 کیلو باز آن که دارای دو محل ویژه برش توسط Eco RI در دو انتهای خود می باشد مربوط به پروموترمتالوتیونین موش mMTI و ژن هورمون رشد انسان hGH که به آن متصل کرده اند بوده است. اگر چه از این مقدار 8/1 کیلو باز آن مربوط به پروموترژن متالوتیونین موش و 7/1 کیلو باز آن مربوط به ژن ساختمانی
هورمون رشد انسان بوده است. در ژن هورمون رشد نواحی اگزون و انترون و ترتیبات غیر قابل ترجه در طراحی شده بود همچنین در سمت ژن هورمون رشد انسان قطعه ای به اندازه 5/0 کیلو از فاژ طراحی شده که دارای محلهای ویژه ای جهت برش توسط آنزیمهای برش دهنده بوده است. علاوه بر این برای قطعه ای از ژن hGH که در اثر برش توسط دو آنزیم Bg1 II , Pvn II ایجاد می شود پروب طراحی شده بود تزریق در یک پتری دیش پر از آب به کمک استریومیکروسکوپ (Wild M8) و دو پیپت انجام شد. تخم ها به کمک یک میکروپیپت نگهدارنده که سر آن به شکل فنجان طراحی شده بود مکش و تثبیت و از حرکت آنها به طرفین جلوگیری شد. سپس به کمک میکروپیپت دوم به قطر 5 میکرومتر محلول حاوی DNA از طریق میکروپیل به صفحه زایای تخم ها تزریق شد. مقدار تقریبی 106 کپی از DNA به کمک فشار هوا به هر تخم تزریق شده است. جزئیات تزریق و هچ تا مرحله 90 روز در جدول شماره 2 ذکر شده است.
جدول 2- تعداد تخمهای مورد تزریق، هچ شده و ما هیان پس از 90 روز
Number of in
Jected fish (n)
Surviving to 90
Days of age (n) Hatching rate of in
Jected eggs (controls) Hatched Injected Time of injection
(after spawning)
5(25%)
18(51%)
44(98%)
67(67%) 66%
77%
90%
(75%) 20
35
45
100 30
45
50
125 10 min
21-24 h
40-43 h
در پایان 90روز از تعداد 18 ماهی باقی مانده از تخم هایی که در فاصله زمانی 24-20 ساعت پس از تخم ریزی مورد تزریق قرار گرفته بودند فقط 3 تا از ماهیان سکانس ژن هورمون رشد را دارا بودند. یک قطعه از 44 ماهی باقی مانده از تخم هایی که در فاصله زمانی 43-40 ساعت پس از تخم ریزی مورد تزریق قرار داده شده بودند، ترانسژنیک شده و سکانس ژن را داشته است. تیلاپیا از جمله ما هیانی است که دارای کوریون سفت می باشد. به طوری که نمی توان کوریون آن را به راحتی با میکروپیپت سوراخ
کرد بنابراین نیاز به دستکاریهای دیگر می باشد. ساده ترین و ضروری ترین راه غلبه برسد کوریون، تزریق از راه میکروپیل است که این خود مستلزم نگهداری و تثبیت تخم می باشد. تخم را باید تا زمانی در زیر استریومیکروسکوپ چرخاند تا میکروپیل آن قابل روئیت شود. گاهی در یک آزمایش چندین تکرار لازم است تا میکروپیپت از راه مرکز میکروپیل وارد شود. اگر چه در این تحقیق که مورد دستکاری قرار داده شده اند در مقایسه با شاهد یکسان بوده است.
4-1- انتقال ژن از طریق اسپرم با انکوبه کردن آن در سیستم بافری
کهو (khoo) و همکاران در سال 1992 گزارشی در خصوص ورود ژن خارجی از طریق اسپرماهی زبرا و بررسی اینکه آیا این ژن به نسل های بعد منتقل می شود ارائه کردند. در این تحقیق اسپرم را از ماهیان بالغ به دست آودره و آن را در محلول حاوی پلاسمید نو ترکیب که دارای ژن گزارشگر مورد علاقه بود انکوبه کردند. سپس این اسپرم برای لقاح تخمکهای ماده مورد استفاده قرار داده شد. جنین هایی به دست آمده حاصل از لقاح اسپرم حاوی ژن خارجی و تخمک تا مرحله بلوغ مراقبت شدند همچنین ژنومیک DNA آنها استخراج و بررسی حضور ژن خارجی منتقل شده با تکنیک ساترن بلوت انجام شد ژن گزارشگر مورد علاقه در این تحقیق مشابه پلاسمی
د استفاده شده توسط جونگ (Chong) در سال 1989 پلاسمید pUSV – CAT بوده است. ساختمان این پلاسمید در تصویر5 دیده می شود ژن گزارشگر کرامفنتیل استیل ترانسفراز (CAT) انتخاب شد. زیرا محصول این ژن به سرعت و به سادگی مورد آزمایش قرار می گیرد و علاوه بر این آنزیمی مشابه این در سیستم آنزیمی یوکاریوتها وجود ندارد. پلاسمید PUSV – CAT دارای ترتیبات تکراری برای اتمام از ویروس روزساکروما Rous sarcoma و پروموتر ویروس SV40 در شروع بوده است. مزیت استفاده از ماهیان زبرا جهت این آزمایشات به دلیل دوره کوتاه ایجاد نسل در آنها می باشد. به طوریکه تخم ها در عرض 3 تا 4 روز هچ می شوند و در فاصله زمانی 3 تا 4 ماه ماهیان بالغ می گردند. همچنین تولید ماهیان و نگهداری و مراقبت از لارو آنها در شرایط آزمایشگاهی امکان پذیر است. لقاح تخمک های ماهی زبرا با سلولهای اسپرم که در معرض
پلاسمید نوترکیب قرار گرفته بودند انجام شد. جهت دست آوردن اسپرم نرهای بالغ به اندازه 4-3 سانتی متر و سن 4-3 ماه را تشریح کردند. سپس بیضه ها را جدا کرده و در 100 میکرولیتر بافر PBS قرار دادند. آنگاه آنها را در یک کاغذ پارافین قرار داده و به آرامی خرد کردند. سوسپانسیون هموژن تهیه شده از بیضه های را به اپندروفهای 5/1 میلی لیتری منتقل کردند. تکه های بافتی به وسیله سانتریفوژ با دور g800 برای مدت یک دقیقه، در دمای اطاق جدا کردند. سپس محلول رویی را به اپندروفهای استریل دیگر منتقل کردند. به محلول رویی حاوی اسپرم 900 میکرولیتر از بافر PBS اضافه نمودند. در ادامه پس آنها را به مدت 3 دقیقه با دور 4000 سانتریفوژ کرده و محلول رویی را مجدداً جدا نمودند. این فرآیند را دو مرحله تکرار کردند. پس از شستشوی نهایی اسپرمها را در سپانسیون 25 میکرولیتری از بافر قرار دادند. به این سوسپانسیون آماده
پلاسمید pUSV-CAT که به فرمهای خطی و حلقوی بود اضافه شد. پس از مخلوط کردن برای این مدت 30 تا 40 دقیقه در دمای 22 درجه سانتی گراد انکوبه گردیدند. سپس تخمکهای رسیده را از ماهیان ماده به دست آورده، در یک پتری دیش به دو قسمت مساوی تقسیم کردند، یک قسمت به آرامی با 25 میکرولیتر از سوسپانسیون حاوی اسپرم که با یلاسمیدانکوبه شده بود و نصف دیگر آن را با اسپرم شاهد که تحت تیمارپلاسمید قرار نگرفته بود لقاح دادند. به کمک نمونه برداری از لاروها خا در سن یک هفتگی و برش باله سینه ای از ماهیان بالغ DNA استخراج و بررسی به روش ساترن بلوتینگ روی DNA با کلرامفنیل نشانه دار به عنوان سربستر انکو به شود فرم
استیله شده آن تولید خواهد شد که پس از جدا سازی بوسیله کروماتوگرافی قابل تشخیص است. نتایج نشان داد که، پلاسمید حاوی ژن گزارشگر CAT در ماهیان و زاده های نسل بعد آن ظاهر می شود. سنجش آنزیمی CAT روی ماهیان و زاده ها نشانگر عدم ابرازژن به پلی پیتید بوده است. از طرف دیگر استیورات (Stuort) و همکاران در سال 1990 روش میکرواینجکشن را با همین پلاسمید بر روی همین گونه ماهی به کار گرفتند در این تحقیق ابرازژن به پلی پییتید صورت گرفت بنابراین عدم بیان ژن به
علت خصوصیات ذاتی ماهیان یا عدم شرکت پروموتریلاسمید در رونویسی نمی باشد، اغلب باشد ممکن است ژنی که با استفاده از ناقل اسپرم وارد می شود تغییر کرده و ترتیب جدیدی پیدا نماید به طوری که ژن بیان نشود. این اختلاف در ابرازژن وابسته به دقایقی است که در مقدمه ژن خارجی (پروماتور) صورت می گیرد در میکرواینجکشن استیورات، DNA پلاسمید در مرحله میتوز به میزبان معرفی شده است. تعداد دیگر از محققان با به کارگیری پلاسمیدها و کار روی سایر ماهیان نیز عدم بیان ژن را گزارش کرده اند. یکی از دلایل عدم بیان ژن ناشی از این است که، پروموترو اینهنسر مورد استفاده در ماهی به عنوان نواحی شروع شناخته نمی شوند. به نظر نمی رسد که شکل خطی بودن یا حلقوی بودن DNA برای انتقال آمیز ژن در ماهی تأثیری داشته باشد بلکه هر دو شکل DNA اثرات مشابهی از خود نشان می دهند.
تصویر 5- دیاگرام پلاسمید pUSV-CAT در آن قطعه RSV LTR , CAT و نواحی پروموتر و اینهسنر SV40 نشان داده شده است جایگاه برش توسط آنزیمهای برش دهنده شامل (Kpn I) K , (Ps II) P , (Sal I)S می با شد در اثر برش توسط آنزیم Ps II دو قطعه 63/4 و 24/3 کیلو جفت بازی ایجاد می شود.
5-1- انتقال ژن از طریق اسپرم با الکتروپورشن در سیستم بافری
در سال 1993 سین (Sin) و همکاران انتقال ژن به ما هی آزاد چنوک را از طریق اسپرم به کمک الکتروپورشن انجام دادند. برای این منظور از پلاسمید pRSV-LacZ استفاده کردند (تصویر 6) این پلاسمید آن LacZ و ناحیه اتمام
(Rous sarcama virus) RSV و قطعه ای از ژن SV40 و دو ناحیه برش توسط آنزیمهای Pst I , Hind III داشته است. سلولهای اسپرم جهت الکتروپورشن در شرایط دمای سرد ناشی از آب یخ در طی آزمایش نگهداری شند. حدود نیم میلی لیتر اسپرم با نیم میلی لیتر از باز HEPES حاوی 10 میکروگرم پلاسمید مخلوط کرده و آنها را در معرض پالس میدان الکتریکی با قدرت های متفاوت قرار دادن جزیئات نتایج در جدول شماره 3 بیان شده است.
نتایج نشان داد، که در قدرت میدان 625 ولت بر سانتی متر و پالس 6/18 میلی ثانیه است نسبت ماهیانی که پلاسمید را دریافت داشتند 2 به 20 بوده است. همچنین در قدرت میدان 1150 و پالس 6/18 این نسبت 1 به 20 بوده است. اگر اسپرم دارای تحریک پذیری (Motility) باشد خواهد توانست غشاء سیتوپلاسمی تخمک ارتباط برقرار کرده و به آن نفوذ نماید. بنابراین سنجش تحریک پذیری اسپرم شاخص مناسبی جهت تشخیص توانایی آن در لقاح است. این تحریک پذیری ممکن است تحت تأثیر رقیق کننده ها قرار گیرد. بیلارد (Billard) در سال 1993 نشان داد که، رقیق کردن اسپرمها به نسبت به 1 به 100 برای داشتن 100 درصد اسپرم با تحریک پذیری مناسب جهت القاح لازم می باشد. با این وجود رقت انجام شده در این تحقیق به نسبت 1 به 1 شاید تخمین مناسبی نبوده است. از طرف دیگر موقعی که میدان قوی تر یا پالس
طولانی تر شود تحریک پذیری اسپرم کاهش می یابد. عین همین مسئله در زمینه الکتروپورشن روی کشت های سلولی گزارش شده است. همچنین قدرت یونی بافر هم روی توانایی زیست اسپرم مؤثر است. در این تحقیق اختلاف معنی داری بین میزان بافی ماندگی تخم هایی که تحت اثر میدان الکتریکی و پالس های مختلف قرار گرفته بودند با تخم هایی که تحت سیستم بافری بدون پالس قرار داده شدند مشاهده نشده است. بلکه از نظر باقی ماندگی مشابه بوده اند. همچنین رشد جنینی در تخم هایی که تحت تمیار بافری قرار داده نشدند با تخم هایی که تحت تمیار بافری قرار گرفته بودند و تخم هایی که تحت الکتروپورشن بوند یکسان بوده است. اختلافی که در نتایج الکتروپورشن با اسپرم گون های مختلف است. کارایی میزان ورود پلاسمید به سلول گیرنده در الکتروپورشن به نوع سلول پارامترهای مختلف دیگری بستگی دارد.
سین و همکاران گزارش کردند که ، در خصوص ورود یا عدم ورود DNA پلاسمید به میزبان اطلاعی ندارند اگر چه باندی از DNA پلاسمید با DNA میزبان را مشاهده کرند. ولی در عین حال باندهایی از DNA با وزن ملوکولی کم را هم مشاهده کردند. نظیر این پدیده روی ماهی لوچن توسط کوزلو (Kozlov) در سال 1989 گزارش شده است. علاوه بر این در ماهی قزل آلای 6 تا 12 ماه پلاسمید خارج کروموزومی گزارش شده است. اگر چه کهو در سال 1992 از پلاسمید خطی و حلقوی استفاده کرد و گزارش کرد که هر دوی اینها خارج کروزومی هستند جانگ (Chong) در سال 1989 DNA پلاسمیدهای خطی و سوپر کویل را به تخم های لقاح یافته مدوکا تزریق کرد و مشاهده
کرد که DNA پلاسمید خطی پس از 5 دقیقه به صورت به هم پیوسته می شود. از طرف دیگر زمانی که DNA سوپر کویل را تزریق کرد مشاهده کرد DNA پلاسمیدی در سه فرم سوپر کویل و حلقوی با یک شکست و واحدهای متعدد حلقوی وجود دارد.